डबल-स्ट्रँडेड RNA (dsRNA) ELISA KIT

हे किट बायोटिन-स्ट्रेप्टाव्हिडिन प्रणालीसह एन्झाइम-लिंक केलेले इम्युनोसॉर्बेंट परख (ELISA) युग्मन आहे, 60 बेस जोड्या (bp) पेक्षा जास्त लांबी असलेल्या dsRNA च्या परिमाणात्मक मापनासाठी, क्रमाची पर्वा न करता.प्लेटला अँटी-डीएसआरएनए अँटीबॉडीने पूर्व-लेपित केले गेले आहे.नमुन्यात उपस्थित dsRNA जोडले जाते आणि विहिरींवर लेपित प्रतिपिंडांना बांधले जाते.आणि नंतर बायोटिनिलेटेड अँटी-dsRNA अँटीबॉडी जोडली जाते आणि नमुन्यात dsRNA ला जोडली जाते.धुतल्यानंतर, एचआरपी-स्ट्रेप्टाव्हिडिन जोडले जाते आणि बायोटिनिलेटेड अँटी-डीएसआरएनए अँटीबॉडीशी जोडले जाते.उष्मायनानंतर अनबाउंड HRP-Streptavidin वाहून जाते.नंतर TMB सब्सट्रेट सोल्यूशन HRP द्वारे जोडले जाते आणि उत्प्रेरित केले जाते आणि निळ्या रंगाचे उत्पादन तयार केले जाते जे अम्लीय स्टॉप सोल्यूशन जोडल्यानंतर पिवळ्या रंगात बदलते.पिवळ्या रंगाची घनता प्लेटमध्ये कॅप्चर केलेल्या dsRNA च्या लक्ष्य प्रमाणाच्या प्रमाणात असते.शोषकता 450 एनएमवर मोजली जाते.

अर्ज

हे किट अवशिष्ट dsRNA च्या परिमाणात्मक मापनासाठी आहे.

किटचे घटक

स्टोरेज आणि स्थिरता

1. न वापरलेल्या किटसाठी: संपूर्ण किट शेल्फ लाइफमध्ये 2~8℃ वर साठवले जाऊ शकते.स्टोरेज स्थिरतेसाठी मजबूत प्रकाश टाळावा.

2. वापरलेल्या किटसाठी: मायक्रोप्लेट उघडल्यानंतर, कृपया न वापरलेल्या विहिरींना प्लेट सीलरने झाकून टाका आणि डेसिकंट पॅक असलेल्या फॉइलच्या पाऊचवर परत या, फॉइल पाऊचला झिप-सील करा आणि वापरल्यानंतर शक्य तितक्या लवकर 2~8℃ वर परत या.इतर अभिकर्मक वापरल्यानंतर शक्य तितक्या लवकर 2~8℃ वर परत केले पाहिजेत.

आवश्यक साहित्य पण पुरवले नाही

1. 450±10nm फिल्टरसह मायक्रोप्लेट रीडर (450 आणि 650 nm तरंगलांबीवर शोधता आले तर चांगले).

2. मायक्रोप्लेट शेकर.

3. RNase-मुक्त टिपा आणि सेंट्रीफ्यूज ट्यूब.

ऑपरेशन फ्लोचार्ट

आपण सुरू करण्यापूर्वी

1. वापरण्यापूर्वी किटचे सर्व घटक आणि नमुने खोलीच्या तापमानावर (18-25℃) आणा.किट एकाच वेळी वापरता येणार नसल्यास, कृपया सध्याच्या प्रयोगासाठी फक्त पट्ट्या आणि अभिकर्मक काढा आणि उर्वरित पट्ट्या आणि अभिकर्मक आवश्यक स्थितीत ठेवा.

2. वॉश बफर: 1× वॉश बफरचे 800mL तयार करण्यासाठी 20× एकाग्र वॉश बफरचे 40mL 760mL डिआयोनाइज्ड किंवा डिस्टिल्ड वॉटरने पातळ करा.

3. मानक: वापरण्यापूर्वी स्टॉक सोल्यूशन थोडक्यात फिरवा किंवा सेंट्रीफ्यूज करा.प्रदान केलेल्या चार मानकांची एकाग्रता 5ng/μL आहे.UTP आणि pUTP dsRNA मानकांसाठी, कृपया स्टँडर्ड वक्र काढण्यासाठी STE बफरसह स्टॉक सोल्यूशन 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL वर पातळ करा.N1-Me-pUTP dsRNA मानकांसाठी, मानक वक्र काढण्यासाठी कृपया स्टॉक सोल्यूशन 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL STE बफरसह पातळ करा.5-OMe-UTP dsRNA मानकांसाठी, मानक वक्र काढण्यासाठी कृपया स्टॉक सोल्यूशन 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL STE बफरसह पातळ करा.आम्ही शिफारस करतो की मानके खालील तक्त्याप्रमाणे पातळ केली जाऊ शकतात:

4. बायोटिनिलेटेड डिटेक्शन अँटीबॉडी आणि एचआरपी-स्ट्रेप्टाव्हिडिन कार्यरत समाधान: वापरण्यापूर्वी स्टॉक सोल्यूशन थोडक्यात फिरवा किंवा सेंट्रीफ्यूज करा.डायल्युशन बफरसह त्यांना कार्यरत एकाग्रतेमध्ये पातळ करा.

5. टीएमबी सबस्टेट: निर्जंतुकीकरण केलेल्या टिपांसह द्रावणाचा आवश्यक डोस घ्या आणि उरलेले द्रावण पुन्हा कुपीमध्ये टाकू नका.टीएमबी सबस्टेट प्रकाशासाठी संवेदनशील आहे, टीएमबी सब्सट्रेटला जास्त काळ प्रकाशात आणू नका.

प्रोटोकॉल वापरणे

1. परीक्षणासाठी आवश्यक असलेल्या पट्ट्यांची संख्या निश्चित करा.वापरण्यासाठी फ्रेम्समध्ये पट्ट्या घाला.या परीक्षणात न वापरलेल्या उरलेल्या प्लेट स्ट्रिप्स डेसिकंटने बॅगमध्ये पुन्हा पॅक कराव्यात.रेफ्रिजरेटेड स्टोरेजसाठी बॅग घट्ट बंद करा.

2. योग्य विहिरींमध्ये मानक, कोरे आणि नमुने प्रत्येकी 100μL जोडा.प्लेट सीलरने झाकून ठेवा.500rpm वर थरथरणाऱ्या तपमानावर 1 तास उष्मायन करा.अचूक तपासणीसाठी नमुने योग्य एकाग्रतेसाठी STE बफरने पातळ केले पाहिजेत.

3. वॉश स्टेप: सोल्युशन एस्पिरेट करा आणि प्रत्येक विहिरीला 250μL वॉश बफरने धुवा आणि 30 पर्यंत उभे राहू द्या.प्लेटला शोषक कागदावर स्नॅप करून वॉश बफर पूर्णपणे काढून टाका.पूर्णपणे 4 वेळा धुवा.

4. प्रत्येक विहिरीत 100μL बायोटिनिलेटेड डिटेक्शन अँटीबॉडी वर्किंग सोल्यूशन घाला.प्लेट सीलरने झाकून ठेवा.500rpm वर थरथरणाऱ्या तपमानावर 1 तास उष्मायन करा.

5. धुण्याची पायरी पुन्हा करा.

6. प्रत्येक विहिरीत 100μL HRP-streptavidin कार्यरत द्रावण घाला.प्लेट सीलरने झाकून ठेवा.500rpm वर थरथरणाऱ्या तपमानावर 30 मिनिटे उष्मायन करा.

7. पुन्हा धुण्याची पायरी पुन्हा करा.

8. प्रत्येक विहिरीत 100μL TMB सब्सट्रेट द्रावण घाला.प्लेट सीलरने झाकून ठेवा.प्रकाशापासून संरक्षण करण्यासाठी आरटी येथे 30 मिनिटे उष्मायन करा.सब्सट्रेट सोल्यूशन जोडल्याने द्रव निळा होईल.

9. प्रत्येक विहिरीत 50μL स्टॉप सोल्यूशन घाला.स्टॉप सोल्यूशन जोडल्याने द्रव पिवळा होईल.नंतर मायक्रोप्लेट रीडर चालवा आणि लगेच 450nm वर मापन करा.

परिणामांची गणना

1. प्रत्येक मानक, नियंत्रण आणि नमुन्यांची सरासरी डुप्लिकेट वाचन करा आणि सरासरी शून्य मानक ऑप्टिकल घनता वजा करा.उभ्या(Y) अक्षावर शोषकता आणि क्षैतिज (X) अक्षावर dsRNA एकाग्रतेसह मानक वक्र तयार करा.

2. 5 किंवा 4 पॅरामीटर नॉन-लिनियर फिट मॉडेलमध्ये वक्र तज्ञ 1.3 किंवा ELISA Calc सारख्या संगणक-आधारित वक्र-फिटिंग सॉफ्टवेअरसह गणना करण्याची शिफारस केली जाते.

कामगिरी

1. संवेदनशीलता:

शोधण्याची कमी मर्यादा: ≤ 0.001pg/μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA साठी), ≤ 0.01pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA साठी).

परिमाणाची कमी मर्यादा: 0.0156 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNA साठी), 0.0312 pg/μL (N1-Me-pUTP-dsRNA साठी), 0.0625 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA साठी).

2. अचूकता: इंट्रा-परीक्षा ≤10%, आंतर-परीक्षा ≤10% चे CV

3. पुनर्प्राप्ती: 80% ~ 120%

4.रेखीयता:0.0156-0.5pg/μL(UTP-,pUTP-dsRNA साठी)0.0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA), 0.0625-1pg/μL(5-OMe-UTP-dsRNA साठी).

विचार

1. TMB प्रतिक्रिया तापमान आणि वेळ गंभीर आहे, कृपया सूचनांनुसार त्यांना काटेकोरपणे नियंत्रित करा.

2. चांगली परख पुनरुत्पादकता आणि संवेदनशीलता प्राप्त करण्यासाठी, अतिरिक्त न-प्रतिक्रिया केलेले अभिकर्मक काढून टाकण्यासाठी प्लेट्सची योग्य धुलाई आवश्यक आहे.

3. सर्व अभिकर्मक वापरण्यापूर्वी पूर्णपणे मिसळले पाहिजेत आणि नमुना किंवा अभिकर्मक जोडताना अडथळे टाळावेत.

4. जर एकाग्र वॉश बफरमध्ये (20x) स्फटिक तयार झाले असतील तर, 37℃ पर्यंत उबदार करा आणि स्फटिक पूर्णपणे विरघळेपर्यंत हलक्या हाताने मिसळा.

5. सोडियम अझाइड (NaN3) असलेल्या नमुन्यांची तपासणी टाळा, कारण ते HRP क्रियाकलाप नष्ट करू शकते ज्यामुळे dsRNA चे प्रमाण कमी होते.

6. तपासणी दरम्यान RNase दूषित होणे टाळा.

7. स्टँडर्ड/नमुना, डिटेक्शन अँटीबॉडी आणि SA-HRP देखील RT वर हलवल्याशिवाय आयोजित केले जाऊ शकतात, परंतु यामुळे शोध संवेदनशीलता एक पट कमी होऊ शकते.या प्रकरणात, आम्ही शिफारस करतो की UTP आणि pUTP dsRNA मानक 2pg/μL वरून पातळ केले जावे, N1-Me-pUTP dsRNA मानक 4pg/μL आणि 5-OMe-UTP dsRNA मानक 8pg/μL वरून पातळ केले जावे.याव्यतिरिक्त, खोलीच्या तपमानावर 60 मिनिटांसाठी एचआरपी-स्ट्रेप्टाव्हिडिन कार्यरत द्रावण उबवा.फ्लास्क शेकर वापरू नका, कारण फ्लास्क शेकरचा परिणाम चुकीचा होऊ शकतो.

ठराविक परिणाम

1. मानक वक्र डेटा

2. मानक वक्र गणना

3. लाइनर शोध श्रेणी: 0.0312- 1pg/μL