mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2´ -O-methyltransferase हे रीकॉम्बीनंट E. coli स्ट्रेनपासून प्राप्त झाले आहे जे mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase या लसीचे जनुक घेऊन जाते.हे एंझाइम RNA च्या 5'एंडवर कॅप स्ट्रक्चरला लागून असलेल्या पहिल्या न्यूक्लियोटाइडच्या 2´-O स्थानावर एक मिथाइल गट जोडते. एंझाइम S-adenosylmethionine (SAM) ला मिथाइल दाता म्हणून मिथाइल कॅप्ड RNA (कॅप) वापरतो. -0) परिणामी कॅप- 1 रचना.

Cap1 रचना ट्रान्सफेक्शन आणि मायक्रोइंजेक्शन प्रयोगांमध्ये mRNA ची अभिव्यक्ती सुधारून भाषांतर कार्यक्षमता वाढवू शकते. या एन्झाइमला विशेषत: सब्सट्रेट म्हणून m7GpppN कॅपसह RNA आवश्यक आहे.ते 5´ शेवटी pN, ppN, pppN किंवा GpppN सह RNA वापरू शकत नाही.कॅप्ड आरएनए कॅप ॲनालॉग वापरून इन विट्रो ट्रान्सक्रिप्शनद्वारे किंवा व्हॅक्सिनिया कॅपिंग एंझाइम वापरून एन्झाईमॅटिक कॅपिंगद्वारे तयार केले जाऊ शकते.

घटक

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)

10×कॅपिंग रिॲक्शन बफर

स्टोरेज

-25 ～- 15℃ स्टोरेजसाठी （पुन्हा फ्रीझ-थॉ सायकल टाळा）

स्टोरेज बफर

20 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% ट्रायटन X- 100，50% ग्लिसरॉल.

युनिट व्याख्या

एका युनिटची व्याख्या 37°C तापमानात 1 तासात 80 nt कॅप्ड RNA ट्रान्सक्रिप्टच्या 10 pmoles मेथिलेट करण्यासाठी आवश्यक एन्झाइमची मात्रा म्हणून केली जाते.

गुणवत्ता नियंत्रण तपासणी

Exonuclease1μg λ-हिंद III डायजेस्ट DNA सह mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase चे :50U 37 ℃ वर 16 तासांसाठी ॲग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसने निर्धारित केल्याप्रमाणे कोणतेही ऱ्हास होत नाही.

एंडोन्यूक्लीज: mRNA कॅप 2 ´ -O-Methyltransferase ची 50 U 1 μg λDNA सह 37℃ वर 16 तासांसाठी ॲग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसने निर्धारित केल्याप्रमाणे कोणतेही ऱ्हास होत नाही.

निकसे: mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase चे 50U 1μg pBR322 सह 37 ℃ वर 16 तासांसाठी ॲग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसने निर्धारित केल्याप्रमाणे कोणतेही ऱ्हास होत नाही.

RNase: mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase चे 50U 1.6μg MS2 RNA सह 37℃ तापमानात 4 तासांसाठी ॲग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसने निर्धारित केल्याप्रमाणे कोणतेही ऱ्हास होत नाही.

E. कोली डीएनए: mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase च्या 50U च्या उपस्थितीसाठी तपासणी केली जातेE. कोली साठी विशिष्ट प्राइमर्ससह TaqMan qPCR वापरून जीनोमिक डीएनएE. कोली 16S rRNA लोकस.दE. कोली जीनोमिक डीएनए दूषितता =1 आहेE. कोली जीनोम

जिवाणू एंडोटॉक्सिन: LAL-चाचणी, चीनी फार्माकोपिया IV 2020 आवृत्तीनुसार, जेल मर्यादा चाचणी पद्धत, सामान्य नियम (1143).बॅक्टेरियल एंडोटॉक्सिन सामग्री = 10 EU/mg असावी.

प्रतिक्रिया प्रणाली आणि परिस्थिती

1. कॅप्ड RNA आणि RNase-मुक्त H2O ची योग्य मात्रा 1.5 mL मायक्रोफ्यूज ट्यूबमध्ये 16.0 μL च्या अंतिम व्हॉल्यूममध्ये एकत्र करा.

2. 5 मिनिटांसाठी 65℃ वर गरम करा आणि त्यानंतर 5 मिनिटे बर्फ-स्नान करा.

3. खालील घटक नमूद केलेल्या क्रमाने जोडा (कॅप्ड RNA च्या मेथिलेशनसाठी

10 पेक्षा कमी

*10× कॅपिंग रिॲक्शन बफर : 500 mM Tris-HCl(pH 8.0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、10 mM DTT.

4. 1 तासासाठी 37℃ वर उष्मायन करा (200 nt पेक्षा कमी टार्गेट फ्रॅगमेंटसाठी 2 तास उष्मायनाची शिफारस केली जाते).

अर्ज

मायक्रोइंजेक्शन आणि ट्रान्सफेक्शन प्रयोगांदरम्यान mRNA अभिव्यक्ती सुधारण्यासाठी.

वापरावरील टिपा

1. प्रतिक्रियेपूर्वी, RNA शुद्ध केले पाहिजे आणि न्यूक्लिझ-मुक्त पाण्यात विरघळले पाहिजे, सर्व द्रावणांमध्ये कोणतेही EDTA आणि आयन नसावेत.

2. प्रतिक्रियेच्या 5'एंडवरील दुय्यम रचना काढून टाकण्यासाठी प्रतिक्रियेपूर्वी 5 मिनिटांसाठी नमुना RNA 65℃ वर गरम करण्याची शिफारस केली जाते.जटिल 5 ´ -टर्मिनल स्ट्रक्चरसाठी ते 10 मिनिटांपर्यंत वाढवले ​​जाऊ शकते.