PNGase F
पेप्टाइड-एन-ग्लायकोसिडेस एफ(पीएनजीसे एफ) ही ग्लायकोप्रोटीन्समधून जवळजवळ सर्व एन-लिंक्ड ऑलिगोसॅकराइड काढून टाकण्यासाठी सर्वात प्रभावी एंजाइमॅटिक पद्धत आहे.PNGase F एक अमिडेस आहे, जो एन-लिंक्ड ग्लायकोप्रोटीन्सपासून उच्च मॅनोज, हायब्रीड आणि कॉम्प्लेक्स ऑलिगोसॅकराइड्सच्या आतील सर्वात GlcNAc आणि शतावरी अवशेषांमध्ये क्लिव्ह करतो.
अर्ज
हे एन्झाइम प्रथिनांमधून कार्बोहायड्रेटचे अवशेष काढून टाकण्यासाठी उपयुक्त आहे.
तयारी आणि तपशील
| देखावा | रंगहीन द्रव |
| प्रथिने शुद्धता | ≥95% (SDS-PAGE वरून) |
| क्रियाकलाप | ≥500,000 U/mL |
| एक्सोग्लायकोसिडेस | कोणतीही गतिविधी आढळली नाही (ND) |
| एंडोग्लायकोसिडेस F1 | ND |
| एंडोग्लायकोसिडेस F2 | ND |
| एंडोग्लायकोसिडेस F3 | ND |
| एंडोग्लायकोसिडेस एच | ND |
| प्रोटीज | ND |
गुणधर्म
| EC क्रमांक | ३.५.१.५२(सूक्ष्मजीव पासून पुन्हा संयोजक) |
| आण्विक वजन | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| आयसोइलेक्ट्रिक पॉइंट | 8. 14 |
| इष्टतम पीएच | ७.०-८.० |
| इष्टतम तापमान | ६५°से |
| सब्सट्रेट विशिष्टता | GlcNAc आणि शतावरी अवशेषांमधील ग्लायकोसिडिक बंध साफ करणे चित्र.1 |
| ओळख साइट्स | एन-लिंक केलेले ग्लाइकन्स α1-3 फ्यूकोज समाविष्ट नसल्यास अंजीर 2 |
| सक्रिय करणारे | डीटीटी |
| अवरोधक | SDS |
| स्टोरेज तापमान | -25 ~-15 ℃ |
| उष्णता निष्क्रियता | 1µL PNGase F असलेले 20µL प्रतिक्रिया मिश्रण 75 °C वर 10 मिनिटांसाठी उष्मायनाद्वारे निष्क्रिय केले जाते. |
अंजीर. 1 PNGase F ची सब्सट्रेट विशिष्टता
Fig. 2 PNGase F ची ओळख पटते.
जेव्हा अंतर्गत GlcNAc अवशेष α1-3 फ्यूकोजशी जोडलेले असतात, तेव्हा PNGase F ग्लायकोप्रोटीन्सपासून N-लिंक्ड ऑलिगोसॅकराइड्स विभक्त करू शकत नाही.हा बदल वनस्पती आणि काही कीटक ग्लायकोप्रोटीनमध्ये सामान्य आहे.
Cघटक
|
| घटक | एकाग्रता |
| 1 | PNGase F | 50 μl |
| 2 | 10×ग्लायकोप्रोटीन डिनॅचरिंग बफर | 1000 μl |
| 3 | 10×ग्लायकोबफर 2 | 1000 μl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 μl |
युनिट व्याख्या
10 μL च्या एकूण प्रतिक्रिया व्हॉल्यूममध्ये 37°C वर 1 तासात विकृत RNase B च्या 10 µg मधून कार्बोहायड्रेटचे >95% काढून टाकण्यासाठी आवश्यक एंजाइमचे प्रमाण म्हणून एक युनिट(U) परिभाषित केले जाते.
प्रतिक्रिया परिस्थिती
1. 1-20 µg ग्लायकोप्रोटीन डिआयोनाइज्ड पाण्यात विरघळवा, 1 µl 10×ग्लायकोप्रोटीन डिनेचरिंग बफर आणि H2O (आवश्यक असल्यास) 10 µl एकूण प्रतिक्रिया व्हॉल्यूम बनवा.
2.100 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 10 मिनिटे उबवा, बर्फावर थंड करा.
3.2 μl 10×GlycoBuffer 2, 2 μl 10% NP-40 जोडा आणि मिक्स करा.
4.1-2 μl PNGase F आणि H जोडा2O (आवश्यक असल्यास) 20 μl एकूण प्रतिक्रिया व्हॉल्यूम आणि मिक्स करण्यासाठी.
5.60 मिनिटांसाठी 37°C वर उष्मायन प्रतिक्रिया.
6.SDS-PAGE विश्लेषण किंवा HPLC विश्लेषणासाठी.
