व्हॅक्सिनिया व्हायरस कॅपिंग एन्झाइम
व्हॅक्सिनिया व्हायरस कॅपिंग एंझाइम हे रीकॉम्बिनंट ई. कोलाई स्ट्रेनपासून प्राप्त झाले आहे ज्यामध्ये व्हॅक्सिनिया कॅपिंग एंझाइमची जीन्स असते.हे एकल एंझाइम दोन सबयुनिट (D1 आणि D12) ने बनलेले आहे आणि त्यात तीन एन्झाइमॅटिक क्रियाकलाप आहेत (D1 सब्यूनिटद्वारे RNA ट्रायफॉस्फेटेस आणि ग्वानिलट्रान्सफेरेस आणि D12 सब्यूनिटद्वारे ग्वानाइन मेथिलट्रान्सफेरेस).व्हॅक्सिनिया व्हायरस कॅपिंग एंझाइम कॅप स्ट्रक्चरच्या निर्मितीला उत्प्रेरित करण्यासाठी प्रभावी आहे, जे विशेषतः RNA च्या 5′ टोकाशी 7-मेथिलगुआनिलेट कॅप स्ट्रक्चर (m7Gppp, Cap 0) जोडू शकते.कॅप स्ट्रक्चर (कॅप 0) युकेरियोट्समध्ये mRNA स्थिरीकरण, वाहतूक आणि भाषांतरात महत्त्वाची भूमिका बजावते.एन्झाईमॅटिक रिॲक्शनद्वारे आरएनए कॅपिंग ही एक प्रभावी आणि सोपी पद्धत आहे जी इन विट्रो ट्रान्सक्रिप्शन, ट्रान्सफेक्शन आणि मायक्रोइंजेक्शनसाठी आरएनएची स्थिरता आणि भाषांतर लक्षणीयरीत्या सुधारू शकते.
घटक
व्हॅक्सिनिया व्हायरस कॅपिंग एन्झाइम (10 U/μL)
10×कॅपिंग बफर
स्टोरेज परिस्थिती
-25～- स्टोरेजसाठी 15℃ （पुन्हा फ्रीझ-थॉ सायकल टाळा）
स्टोरेज बफर
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,
1mM DTT, 0. 1mm EDTA, 0. 1% ट्रायटन X- 100, 50% ग्लिसरॉल.
युनिट व्याख्या
व्हॅक्सिनिया व्हायरस कॅपिंग एंझाइमचे एक युनिट 37 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 1 तासात 10pmol GTP च्या 80nt ट्रान्सक्रिप्टमध्ये समाविष्ट करण्यासाठी आवश्यक एन्झाइमचे प्रमाण म्हणून परिभाषित केले आहे.
गुणवत्ता नियंत्रण
Exonuclease:1μg λ-Hind III डायजेस्ट DNA सह 10U व्हॅक्सिनिया व्हायरस कॅपिंग एंझाइम 37 ℃ वर 16 तासांसाठी ॲगरोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसने निर्धारित केल्यानुसार कोणतेही ऱ्हास होत नाही.
एंडोन्यूक्लीज:1μg λDNA सह 1μg λDNA सह 16 तासांसाठी 10U वॅक्सिनिया व्हायरस कॅपिंग एंझाइम 16 तासांसाठी ॲग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसद्वारे निर्धारित केल्यानुसार कोणतेही ऱ्हास होत नाही.
निकसे:10U व्हॅक्सिनिया व्हायरस कॅपिंग एंझाइम 1 μg pBR322 सह 37 ℃ वर 16 तासांसाठी 16 तासांसाठी ॲग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसद्वारे निर्धारित केल्यानुसार कोणतेही ऱ्हास होत नाही.
RNase:1.6μg MS2 RNA सह व्हॅक्सिनिया व्हायरस कॅपिंग एंझाइमचे 10U 37℃ तापमानात 4 तासांसाठी ॲग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसने निर्धारित केल्यानुसार कोणतेही ऱ्हास होत नाही.
1.कोलाय डीएनए:E. coli 16S rRNA लोकससाठी विशिष्ट प्राइमर्ससह TaqMan qPCR वापरून E. coli genomic DNA च्या उपस्थितीसाठी Vaccinia व्हायरस कॅपिंग एंझाइमचे 10U तपासले जाते.E. coli genomic DNA दूषितता ≤1 E. coli जीनोम आहे.
2.जिवाणू एंडोटॉक्सिन: LAL-चाचणी, चीनी फार्माकोपिया IV 2020 आवृत्तीनुसार, जेल मर्यादा चाचणी पद्धत, सामान्य नियम (1143).बॅक्टेरियल एंडोटॉक्सिन सामग्री ≤10 EU/mg असावी.
प्रतिक्रिया प्रणाली आणि परिस्थिती
1. कॅपिंग प्रोटोकॉल (प्रतिक्रिया खंड: 20 μL)
ही प्रक्रिया 10μg RNA (≥100 nt) च्या कॅपिंग प्रतिक्रियेला लागू आहे आणि ती प्रायोगिक मागणीनुसार वाढविली जाऊ शकते.
I) 1.5 मिली मायक्रोफ्यूज ट्यूबमध्ये 10μg RNA आणि न्यूक्लिझ-फ्री H2O एकत्र करा आणि अंतिम व्हॉल्यूम 15.0 μL.*10×कॅपिंग बफर: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8.0)
2) 5 मिनिटांसाठी 65 डिग्री सेल्सियस वर गरम करा आणि त्यानंतर 5 मिनिटे बर्फ स्नान करा.
3) नमूद केलेल्या क्रमाने खालील घटक जोडा
| Cघटक | Vऑल्युम |
| विकृत RNA (≤10μg, length≥100 nt) | 15 μL |
| 10×कॅपिंग बफर* | 2 μL |
| GTP (10 मिमी) | 1 μL |
| SAM (2 मिमी) | 1 μL |
| व्हॅक्सिनिया व्हायरस कॅपिंग एन्झाइम (10U/μL) | 1 μL |
*10×कॅपिंग बफर: 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8.0)
4) 37°C वर 30 मिनिटे उष्मायन करा, RNA आता बंद आहे आणि डाउनस्ट्रीम ऍप्लिकेशन्ससाठी तयार आहे.
2. 5′ टर्मिनल लेबलिंग प्रतिक्रिया (प्रतिक्रिया खंड: 20 μL)
हा प्रोटोकॉल 5´ ट्रायफॉस्फेट असलेले RNA लेबल करण्यासाठी डिझाइन केले आहे आणि ते मागणीनुसार वाढविले जाऊ शकते.लेबल इनकॉर्पोरेशनच्या कार्यक्षमतेवर RNA: GTP, तसेच RNA नमुन्यांमधील GTP सामग्रीच्या मोलर रेशोवर परिणाम होईल.
1) 1.5 मिली मायक्रोफ्यूज ट्यूबमध्ये योग्य प्रमाणात RNA आणि न्यूक्लिझ-फ्री H2O एकत्र करा आणि अंतिम व्हॉल्यूम 14.0 μL.
2) 5 मिनिटांसाठी 65 डिग्री सेल्सियस वर गरम करा आणि त्यानंतर 5 मिनिटे बर्फ स्नान करा.
3) नमूद केलेल्या क्रमाने खालील घटक जोडा.
| Cघटक | Vऑल्युम |
| विकृत आरएनए | 14 μL |
| 10×कॅपिंग बफर | 2 μL |
| GTP मिक्स** | 2 μL |
| SAM (2 मिमी) | 1 μL |
| व्हॅक्सिनिया व्हायरस कॅपिंग एन्झाइम (10U/μL) | 1 μL |
** GTP मिक्स GTP आणि थोड्या संख्येने मार्करचा संदर्भ देते.GTP च्या एकाग्रतेसाठी, पहाटीप 3.
4) 37°C वर 30 मिनिटे उष्मायन करा, RNA 5′ शेवटी लेबल केले आहे आणि डाउनस्ट्रीमसाठी तयार आहे
अर्ज
1. ट्रान्सलेशन असेस/इन विट्रो ट्रान्सलेशनपूर्वी mRNA कॅपिंग
2. mRNA चा 5´ शेवट लेबल करणे
वापरावरील टिपा
1.वॅक्सिनिया कॅपिंग एंझाइमसह उष्मायनाच्या अगोदर आरएनएचे द्रावण गरम केल्याने प्रतिलेखाच्या 5´एंडवरील दुय्यम रचना काढून टाकली जाते.ज्ञात अत्यंत संरचित 5´एंड्स असलेल्या ट्रान्सक्रिप्टसाठी वेळ 60 मिनिटांपर्यंत वाढवा.
2. कॅपिंग प्रतिक्रियांसाठी वापरलेले RNA वापरण्यापूर्वी शुद्ध केले पाहिजे आणि न्यूक्लीज-मुक्त पाण्यात निलंबित केले पाहिजे.EDTA उपस्थित नसावे आणि द्रावण क्षारमुक्त असावे.
3. 5´ शेवटचे लेबल लावण्यासाठी, एकूण GTP एकाग्रता प्रतिक्रियेतील mRNA च्या मोलर एकाग्रतेच्या सुमारे 1-3 पट असावी.
4. रिॲक्शन सिस्टीमची मात्रा वास्तविकतेनुसार वर किंवा खाली केली जाऊ शकते.
