RTL रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस
RTL रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस हे RNA टेम्प्लेट-आश्रित DNA पॉलिमरेझ आहे ज्यामध्ये 3'→5' एक्सोन्यूक्लीझ क्रियाकलाप नसतो आणि RNase H क्रियाकलाप असतो.हे सजीवांच्या शरीरात निर्मार्ण होणारे द्रव्य DNA च्या पूरक स्ट्रँडचे संश्लेषण करण्यासाठी टेम्पलेट म्हणून RNA वापरू शकते, जे प्रथम-स्ट्रँड cDNA संश्लेषणासाठी लागू केले जाऊ शकते, विशेषत: RT-LAMP (लूप-मध्यस्थ समस्थानिक प्रवर्धन) साठी.RTL रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेज 1.0 च्या तुलनेत, संवेदनशीलता लक्षणीयरीत्या सुधारली आहे, थर्मल स्थिरता अधिक मजबूत आहे आणि 65°C वर प्रतिक्रिया अधिक स्थिर आहे.RTL रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस (ग्लिसरॉल फ्री) लायोफिलाइज्ड तयारी, लायफिलाइज्ड आरटी-एलएएमपी अभिकर्मक इ. तयार करण्यासाठी वापरले जाऊ शकते.
युनिट व्याख्या
एक युनिट टेम्प्लेट-प्राइमर म्हणून पॉली(ए)•ओलिगो(डीटी)25 चा वापर करून 50 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 20 मिनिटांत 1 एनएमओएल डीटीटीपी आम्ल-प्रक्षेपित सामग्रीमध्ये समाविष्ट करते.
घटक
| घटक | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस (ग्लिसरॉल-मुक्त) (15U/μL) | 0.1 मिली | 1 मिली | 10 मिली |
| 10×HC RTL बफर | 1.5 मिली | 4×1.5 मिली | 5×10 मिली |
| MgSO4 (100mm) | 1.5 मिली | 2×1.5 मिली | 3×10 मिली |
स्टोरेज स्थिती
वाहतूक 0°C च्या खाली आणि -25°C~-15°C वर साठवली जावी.
गुणवत्ता नियंत्रण
- च्या अवशिष्ट क्रियाकलापEndonuclease:1 μg λDNA आणि RTL2.0 ची 15 युनिट्स असलेली 50 μL प्रतिक्रिया 37 ℃ वर 16 तास उष्मायन केलेली जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसद्वारे नकारात्मक नियंत्रणाप्रमाणेच नमुना दर्शवते.
- च्या अवशिष्ट क्रियाकलापExonuclease:50 μL प्रतिक्रिया ज्यामध्ये 1 μg हिंद Ⅲ पचलेले λDNA आणि 15 युनिट RTL2.0 37 ℃ तापमानात 16 तास उष्मायन केले जाते ते जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसद्वारे नकारात्मक नियंत्रणाप्रमाणेच नमुना दर्शवते.
- च्या अवशिष्ट क्रियाकलापनिकसे:1 μg सुपरकॉइल केलेले pBR322 आणि RTL2.0 ची 15 युनिट्स असलेली 50 μL प्रतिक्रिया 37°C तापमानावर 4 तास उष्मायन केलेली जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसद्वारे नकारात्मक नियंत्रणाप्रमाणेच नमुना दर्शवते.
- च्या अवशिष्ट क्रियाकलापRNase:10 μL प्रतिक्रिया ज्यामध्ये 0.48 μg MS2 RNA आणि RTL2.0 ची 15 युनिट्स 37°C तापमानावर 4 तास उष्मायनात असतात, ती जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसद्वारे नकारात्मक नियंत्रणाप्रमाणेच नमुना दर्शवते.
- ई कोलाय् gDNA:सह मोजलेई कोलाय्विशिष्ट एचसीडी डिटेक्शन किट，RTL2.0 च्या 15 युनिट्समध्ये 1 पेक्षा कमी आहेई कोलाय्जीनोम
प्रतिक्रिया सेटअप
cDNA संश्लेषण प्रोटोकॉल
| घटक | खंड |
| टेम्पलेट RNA a | पर्यायी |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) किंवा रँडम प्राइमर मिक्स (60uM) | 2 μL |
| dNTP मिक्स (प्रत्येकी 10 मिमी) | 1 μL |
| RNase इनहिबिटर (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| 10×HC RTL बफर | 2 μL |
| न्यूक्लीज मुक्त पाणी | 20 μL पर्यंत |
टिपा:
1) एकूण RNA चा शिफारस केलेला डोस 1ng~1μg आहे
2) mRNA चा शिफारस केलेला डोस 50ng ~ 100ng होता
थर्मो-नित्यक्रमासाठी सायकल चालविण्याच्या अटी प्रतिक्रिया:
| तापमान (°C) | वेळ |
| २५°सेa | ५ मिनिटे |
| ५५°से | 10 मिनिटेb |
| 80°C | 10 मिनिटे |
टिपा:
1) रँडम प्राइमर मिक्स वापरल्यास, 25°C वर उष्मायन चरण.
2) टार्गेट प्राइमर मिक्स वापरल्यास, 10-30 मिनिटांसाठी 55°C वर उष्मायन चरण.
RT-LAMP प्रोटोकॉल
| घटक | खंड | अंतिम एकाग्रता |
| टेम्पलेट आरएनए | पर्यायी | ≥10 प्रती |
| dNTP मिक्स (10mm) | 3.5 μL | 1.4 मिमी |
| FIP/BIP प्राइमर्स (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3/B3 प्राइमर्स (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| लूपएफ/लूपबी प्राइमर्स (२५×) | 1 μL | 0.4 μM |
| RNase इनहिबिटर (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/प्रतिक्रिया |
| RTL रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेज 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U/प्रतिक्रिया |
| Bst V2 DNA पॉलिमरेज (8U/μL) | 1 μL | 8 U/प्रतिक्रिया |
| MgSO4 (100mm) | 1.5 μL | 6 मिमी (एकूण 8 मिमी) |
| 10×HC RTL बफर (किंवा 10×HC Bst V2 बफर) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| न्यूक्लीज मुक्त पाणी | 25 μL पर्यंत | - |
टिपा:
1) गोळा करण्यासाठी थोडक्यांत व्हर्टेक्सिंग आणि सेंट्रीफ्यूज करून मिसळा.1 तासासाठी 65 डिग्री सेल्सिअस तापमानात सतत उष्मायन.
2) दोन बफर इंटरऑपरेबल आहेत आणि त्यांची रचना समान आहे.
नोट्स
1. हे उत्पादन -20 डिग्री सेल्सिअस तापमानात साठवल्यावर पांढरे घन बनते.ते -20 डिग्री सेल्सिअस वरून बाहेर काढा आणि सुमारे 10 मिनिटे बर्फावर ठेवा.वितळल्यानंतर, ते हलवून आणि मिसळून वापरले जाऊ शकते.
2. cDNA उत्पादन -20°C किंवा -80°C वर साठवले जाऊ शकते किंवा PCR प्रतिक्रियेसाठी त्वरित वापरले जाऊ शकते.
3.RNase दूषित होण्यापासून रोखण्यासाठी, कृपया प्रायोगिक क्षेत्र स्वच्छ ठेवा आणि ऑपरेशन दरम्यान स्वच्छ हातमोजे आणि मास्क घाला.
