एंडोफ्री प्लास्मिड मॅक्सी किट
हे किट 150 - 300 मिली बॅक्टेरियाच्या द्रावणातून रात्रभर संवर्धन करण्यासाठी, सुधारित एसडीएस-अल्कलाइन लिसिस पद्धतीचा वापर करून जीवाणू नष्ट करण्यासाठी योग्य आहे.क्रूड अर्क निवडकपणे एक अद्वितीय एंडोटॉक्सिन स्कॅव्हेंजरसह एकत्र केला जातो आणि एंडोटॉक्सिन काढून टाकण्यासाठी सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे वेगळे केले जाते.त्यानंतर, सिलिका जेल झिल्ली उच्च-मीठ आणि कमी-पीएचच्या परिस्थितीत द्रावणातील प्लाझमिड डीएनएला निवडकपणे जोडते.यानंतर अशुद्धी आणि इतर जिवाणू घटक काढून टाकण्यासाठी वॉश बफर जोडले जाते.शेवटी, सिलिकॉन मॅट्रिक्स मेम्ब्रेनमधून शुद्ध प्लास्मिड डीएनए काढण्यासाठी कमी-मीठ, उच्च-पीएच इल्यूशन बफरचा वापर केला जातो.सिलिका जेल झिल्ली विशेष शोषण झिल्ली वापरते, आणि स्तंभ आणि स्तंभ यांच्यातील शोषण रकमेतील फरक खूपच लहान आहे आणि पुनरावृत्ती योग्य आहे.फिनॉल, क्लोरोफॉर्म आणि इतर विषारी अभिकर्मक आवश्यक नाहीत आणि इथेनॉल पर्जन्य चरण देखील नाहीत.या किटचा वापर 80% -90% च्या एक्सट्रॅक्शन दरासह 0.2 -1.5 मिलीग्राम शुद्ध उच्च-कॉपी प्लाझमिड डीएनए वेगाने काढण्यासाठी केला जाऊ शकतो.किटमध्ये एन्डोटॉक्सिन काढून टाकण्यासाठी एक अद्वितीय प्रक्रिया सूत्र वापरण्यात आले आहे, एंडोटॉक्सिनची सामग्री अत्यंत कमी आहे आणि सेल ट्रान्सफेक्शन प्रभाव उत्कृष्ट आहे.काढलेले प्लास्मिड थेट एन्झाइम पचन, पीसीआर, इन विट्रो ट्रान्सक्रिप्शन, ट्रान्सफॉर्मेशन, सिक्वेन्सिंग आणि इतर आण्विक जीवशास्त्र प्रयोगांमध्ये वापरले जाऊ शकते.
स्टोरेज परिस्थिती
RNaseA -30 ~ -15℃ वर संग्रहित केले पाहिजे आणि ≤0℃ येथे वाहतूक केली पाहिजे.
एंडोटॉक्सिन स्कॅव्हेंजर एका महिन्यासाठी 2 ~ 8 ℃ वर साठवले जाऊ शकते, दीर्घकालीन स्टोरेजसाठी -30 ~ -15 ℃ वर साठवले जाऊ शकतेआणि ≤0℃ येथे वाहतूक केली जाते.
इतर घटक खोलीच्या तपमानावर (15 ~ 25 ℃) साठवले पाहिजेत आणि खोलीच्या तपमानावर वाहून नेले पाहिजेत.
घटक
| घटक | 10RXNS |
| आरनेस ए | 750 μL |
| बफर P1 | 75 मिली |
| बफर P2 | 75 मिली |
| बफर P4 | 75 मिली |
| एंडोटॉक्सिन स्कॅव्हेंजर | 25 मि.ली |
| बफर पीडब्ल्यू | 2 × 22 मिली |
| बफर टीबी | 20 मि.ली |
| फास्टप्युअर डीएनए मॅक्सी कॉलम्स (प्रत्येक ५० मिली कलेक्शन ट्यूबमध्ये) | 10 |
| एंडोटॉक्सिन मुक्त संकलन ट्यूब | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, RNA काढण्यासाठी वापरले जाते.
बफर P1:बॅक्टेरियल सस्पेंशन बफर, प्रथम वापरण्यापूर्वी बफर P1 मध्ये RNaseA जोडा.
बफर P2:बॅक्टेरियल लिसिस बफर (एसडीएस/एनएओएच असलेले).
बफर P4:बफर तटस्थ करणे.
एंडोटॉक्सिन स्कॅव्हेंजर:क्रूड प्लाझमिड अर्कातून एंडोटॉक्सिन प्रभावीपणे काढून टाकते.
बफर PW:बफर धुवा, प्रथम वापरण्यापूर्वी इथेनॉलचे निर्धारित प्रमाण जोडा.
बफर टीबी:उत्सर्जन बफर.
फास्टप्युअर डीएनए मॅक्सी कॉलम:प्लाझमिड डीएनए शोषण स्तंभ.
संकलन ट्यूब 50 मिली:फिल्टर कलेक्शन ट्यूब.
एंडोटॉक्सिन-मुक्त संकलन ट्यूब:प्लाझमिड डीएनए संकलन नळ्या.
तयार साहित्य
परिपूर्ण इथेनॉल, आयसोप्रोपॅनॉल, 50 मिली गोल-तळाशी सेंट्रीफ्यूज ट्यूब आणि 50 मिली एंडोटॉक्सिन-मुक्तअपकेंद्रित्र नळ्या.
अर्ज
हे उत्पादन 150 - 300 मिली बॅक्टेरियाच्या द्रावणातून मोठ्या प्रमाणात प्लाझमिड्स काढण्यासाठी योग्य आहेरात्रभर सुसंस्कृत.
प्रयोग प्रक्रिया
1. 150 - 200 मिली (300 मिली पेक्षा जास्त नाही) बॅक्टेरियाचे द्रावण रात्रभर संवर्धन करा आणि अपकेंद्रित करा1 - 2 मिनिटांसाठी सुमारे 11,000 rpm (12,000 × g)सुपरनॅटंट टाकून द्या आणि बॅक्टेरिया गोळा करा.
Δ 50 मिली पेक्षा जास्त जिवाणू द्रावण गोळा करताना, बॅक्टेरियाचे द्रावण जोडून, सेंट्रीफ्यूगेशन, सुपरनॅटंट टाकून आणि त्याच 50 मिली ट्यूबमध्ये इतर पायऱ्या घालून जीवाणू गोळा केले जाऊ शकतात.
अनेक वेळा.
2. सेंट्रीफ्यूजमध्ये 7.5 मिली बफर P1 (कृपया RNaseA बफर P1 मध्ये जोडले गेले आहे का ते तपासा) जोडाजिवाणू असलेली ट्यूब आणि भोवरा किंवा पाइपटिंगद्वारे पूर्णपणे मिसळा.
Δ या पायरीतील बॅक्टेरियाचे पूर्ण पुनरुत्थान उत्पन्न होण्यासाठी महत्त्वपूर्ण आहे आणि पुनरुत्थानानंतर कोणतेही बॅक्टेरियाचे गुच्छे नसावेत.जर तेथे बॅक्टेरियाचे गुठळे असतील जे पूर्णपणे मिसळलेले नसतील, तर ते लिसिसवर परिणाम करेल, परिणामी कमी उत्पादन आणि शुद्धता.जिवाणू द्रावणाचे OD600 0.65 असल्यास, 150 मिली बॅक्टेरियल द्रावणातून काढताना 7.5 मिली बफर पी1 वापरण्याची शिफारस केली जाते;जेव्हा OD600 0.75 असेल तेव्हा बफर P1 चे 8 ml वापरावे आणि बफर P2 आणि P4 चे व्हॉल्यूम त्यानुसार बदलले पाहिजेत.जर बॅक्टेरियाच्या द्रावणाची मात्रा 200 मिली पर्यंत वाढवली असेल, तर अशी शिफारस केली जाते कीP1, P2, आणि P4 बफर्सचे प्रमाण प्रमाणानुसार वाढवले पाहिजे.
3. स्टेप 2 पासून बफर P2 चे 7.5 मिली बॅक्टेरियल सस्पेंशनमध्ये जोडा आणि 6-8 पर्यंत हलक्या हाताने वर आणि खाली मिसळा.वेळा आणि खोलीच्या तपमानावर 4-5 मिनिटे उबवा.
Δ नख मिसळण्यासाठी हळूवारपणे उलटा.व्होर्टेक्सिंगमुळे जीनोमिक डीएनए विखंडन होईल, परिणामी काढलेल्या प्लास्मिडमध्ये जीनोमिक डीएनए तुकडे होतील.यावेळी, द्रावण चिकट आणि अर्धपारदर्शक बनते, हे दर्शविते की जीवाणू पूर्णपणे नष्ट झाले आहेत.प्लास्मिड्सचा नाश टाळण्यासाठी कालावधी 5 मिनिटांपेक्षा जास्त नसावा.उपाय स्पष्ट नसल्यास, परिणामी बरेच जीवाणू असू शकतातअपूर्ण लिसिस, म्हणून बॅक्टेरियाचे प्रमाण योग्यरित्या कमी केले पाहिजे.
4. बफर P4 चे 7.5 मिली स्टेप 3 पासून बॅक्टेरियल सस्पेंशनमध्ये जोडा आणि लगेच 6-8 वेळा हलक्या हाताने उलटा करा जेणेकरून द्रावण पूर्णपणे बफर P2 निष्प्रभावी होईल.यावेळी, पांढरा flocculent precipitate दिसला पाहिजे.10 - 15 मिनिटांसाठी सुमारे 11,000 rpm (12,000 × g) पेक्षा जास्त सेंट्रीफ्यूज करा, सुपरनाटंटला नवीन 50 मिली गोलाकार-तळाशी सेंट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये (स्वत: तयार) काळजीपूर्वक पिपेट करा आणि टाळा.फ्लोटिंग व्हाईट पर्सिपिटेटला एस्पिरेट करा.
Δ बफर P4 जोडा आणि चांगले मिसळण्यासाठी लगेच उलटा.द्रावणात पांढरे अवक्षेपण समान रीतीने वितरीत होईपर्यंत ट्यूबला उभे राहू द्या ज्यामुळे तटस्थीकरणावर परिणाम होऊ शकेल अशा स्थानिक पर्जन्याचे उत्पादन रोखण्यासाठी.सेंट्रीफ्यूगेशनपूर्वी एकसमान पांढरा फ्लोक्युलंट अवक्षेपण नसल्यास आणि सेंट्रीफ्यूगेशननंतर सुपरनेटंट स्पष्ट नसल्यास, ट्यूब असू शकतेआणखी 5 मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज केले.
5. पायरी 4 पासून सुपरनॅटंटमध्ये एंडोटॉक्सिन स्कॅव्हेंजरच्या 0. 1 पट (सुपरनॅटंट व्हॉल्यूमच्या 10%, सुमारे 2.2 मिली) जोडा आणि मिसळण्यासाठी उलटा.द्रावण बर्फाच्या आंघोळीत ठेवा किंवा द्रावण गढूळ वरून स्वच्छ आणि पारदर्शक होईपर्यंत (किंवा स्थिर) 5 मिनिटांसाठी कुस्करलेल्या बर्फात (किंवा रेफ्रिजरेटर फ्रीजर) घाला.किंचित गढूळ), आणि कधीकधी अनेक वेळा मिसळा.
Δ एंडोटॉक्सिन स्कॅव्हेंजर सुपरनाटंटमध्ये जोडल्यानंतर, सुपरनॅटंट गढूळ होईल परंतुबर्फाच्या आंघोळीत थंड झाल्यावर सुपरनॅटंट स्पष्ट (किंवा किंचित टर्बिड) झाले पाहिजे.
6. वरवरचे तपमान 10 - 15 मिनिटांसाठी खोलीच्या तपमानावर (>25℃) ठेवल्यानंतर, ते गढूळ होईलत्याचे तापमान खोलीच्या तापमानापर्यंत वाढते.नंतर सुपरनाटंट मिसळण्यासाठी उलटे केले पाहिजे.
Δ जर खोलीचे तापमान कमी असेल किंवा तुम्हाला काढण्याची वेळ कमी करायची असेल तर, सुपरनॅटंटला 37 ~ 42 ℃ पाण्याच्या बाथमध्ये 5 - 10 मिनिटांसाठी उष्मायन केले जाऊ शकते आणि सुपरनॅटंट नंतर पुढील पायरी केली जाऊ शकते.गढूळ होते.
7. फेज वेगळे करण्यासाठी सुमारे 11,000 rpm (12,000 × g) खोलीच्या तपमानावर (तापमान >25℃ असणे आवश्यक आहे) 10 मिनिटांसाठी सुपरनॅटंटला सेंट्रीफ्यूज करा.वरच्या जलीय टप्प्यात डीएनए असते तर खालच्या निळ्या तेलकट टप्प्यात एंडोटॉक्सिन आणि इतर अशुद्धता असतात.हस्तांतरित कराडीएनए-युक्त जलीय टप्प्यात नवीन ट्यूब आणितेलकट थर टाकून द्या.
Δ सेंट्रीफ्यूगेशन दरम्यान तापमान 25 ℃ पेक्षा जास्त असणे आवश्यक आहे कारण प्रभावी फेज विभक्त होत नाहीतापमान खूप कमी असल्यास उद्भवते.
Δ फेज वेगळे करणे प्रभावी नसल्यास, सेंट्रीफ्यूगेशन तापमान 30 डिग्री सेल्सियस पर्यंत समायोजित केले जाऊ शकते आणिसेंट्रीफ्यूगेशनची वेळ 15 मिनिटांपर्यंत वाढवता येते.
Δ निळा तेलकट थर चोखू नका कारण त्यात एंडोटॉक्सिन आणि इतर अशुद्धी असतात.
यंत्रणा
रिस्पेंशन लिसिस न्यूट्रलायझेशन
◇ 7.5 मिली बफर P1 जोडा
◇ 7.5 मिली बफर P2 जोडा
◇ 7.5 मिली बफर P4 जोडा
एंडोटॉक्सिन काढणे
◇ जोडा 0. एंडोटॉक्सिन स्कॅव्हेंजरच्या सुपरनॅटंट व्हॉल्यूमच्या 1 पट
बंधनकारक आणि धुणे
◇ आयसोप्रोपॅनॉलच्या 0.5 पट जोडा
◇ 10 मिली बफर पीडब्ल्यू जोडा
◇ 10 मिली बफर पीडब्ल्यू जोडा
एल्युशन
◇ 1 - 2 मिली बफर टीबी किंवा एंडोटॉक्सिन-मुक्त ddH2O जोडा
