डीएनए एक्सट्रॅक्शन मिनी किट
हे किट ऑप्टिमाइझ्ड बफर सिस्टीम आणि सिलिका जेल कॉलम प्युरिफिकेशन तंत्रज्ञानाचा अवलंब करते, जे TAE किंवा TBE agarose जेलच्या विविध सांद्रतेतून 70 bp - 20 kb DNA तुकडे पुनर्प्राप्त करू शकते.डीएनए शोषण स्तंभ विशेषत: उच्च-मीठ स्थितीत डीएनए शोषू शकतो.याशिवाय, किट PCR उत्पादने, एंझाइमॅटिक रिॲक्शन सिस्टीम किंवा इतर पद्धतींद्वारे मिळवलेल्या क्रूड डीएनए उत्पादनांमधून थेट डीएनए तुकड्यांना शुद्ध करू शकते आणि प्रथिने, इतर सेंद्रिय संयुगे, अजैविक मीठ आयन आणि ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर्स यांसारख्या अशुद्धता काढून टाकू शकते.हे सुनिश्चित करू शकते की शुद्धीकरण 10-15 मिनिटांत पूर्ण केले जाऊ शकते.शुद्ध केलेला डीएनए थेट लिगेशन, ट्रान्सफॉर्मेशन, एन्झाइम डायजेशन, इन विट्रो ट्रान्सक्रिप्शन, पीसीआर, सिक्वेन्सिंग, मायक्रोइंजेक्शन इत्यादींसाठी वापरला जाऊ शकतो.
स्टोरेज परिस्थिती
-15 ~ -25 ℃ वर साठवा आणि खोलीच्या तपमानावर वाहतूक करा.
घटक
| घटक | (100 rxns) |
| बफर जीडीपी | 80 मिली |
| बफर GW | 2 × 20 मि.ली |
| इल्युशन बफर | 20 मि.ली |
| फास्टप्युअर डीएनए मिनी कॉलम्स-जी | 100 |
बफर जीडीपी:डीएनए बंधनकारक बफर.
बफर GW:वॉशिंग बफर;वापरण्यापूर्वी बाटलीवर सूचित व्हॉल्यूमनुसार परिपूर्ण इथेनॉल घाला.
इल्युशन बफर:एल्युशन.
फास्टप्युअर डीएनए मिनी कॉलम-जी:डीएनए शोषण स्तंभ.
संकलन ट्यूब 2 मिली:फिल्टरसाठी संकलन नळ्या.
तयार साहित्य
1.5 मिली निर्जंतुकीकृत नळ्या, परिपूर्ण इथेनॉल आणि आयसोप्रोपॅनॉल (जेव्हा DNA तुकडा ≤100 bp, 1 खंड जोडा
आयसोप्रोपॅनॉल ते 1 व्हॉल्यूम जेल), वॉटर बाथ.
प्रयोग प्रक्रिया
वापरण्यापूर्वी टॅगवर दर्शविल्यानुसार बफर GW पातळ करण्यासाठी 80 मिली इथेनॉल घाला, खोलीच्या तपमानावर ठेवा.
यंत्रणा
1. पीसीआर प्रतिक्रिया उपाय
जेल एक्सट्रॅक्शन स्कीम: समान व्हॉल्यूम बफर जीडीपी पीसीआर प्रतिक्रिया समाधान पुनर्प्राप्ती योजना जोडा:व्हॉल्यूम बफरच्या 5 पट जोडा
2. GDP जेलच्या व्हॉल्यूमची गणना करा(100 μl 100 mg च्या बरोबरीचे)
जेल विरघळवा
3. 50 ~ 55 वर प्रीहीट करा℃
4. वॉश बांधा
300 μL बफर GDP जोडा*
700 μL बफर GW जोडा
700 μL बफर GW जोडा
5. एल्युट
20 - 30μL इल्युशन बफर किंवा डीआयोनाइज्ड पाणी घाला
नोट्स* या चरणाशिवाय पीसीआर प्रतिक्रिया द्रव पुनर्प्राप्ती
जेल एक्सट्रॅक्शन प्रोग्राम
1. डीएनए तुकड्यांचे अंशीकरण करण्यासाठी डीएनए इलेक्ट्रोफोरेसीस केल्यानंतर, डीएनए तुकड्यांची एकल पट्टी अतिनील प्रकाशाखाली ॲग्रोज जेलमधून काढून टाका.जेलचा स्पष्ट ओलावा शोषून घेण्यासाठी शोषक कागद वापरण्याची शिफारस केली जाते आणि शक्य तितक्या अतिरिक्त ऍग्रोज काढून जेलच्या तुकड्यांचा आकार कमी करा.त्याची मात्रा मोजण्यासाठी जेल स्लाइसचे (मायक्रोसेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबशिवाय) वजन करा: 100 मिलीग्राम जेलस्लाइसचे प्रमाण अंदाजे 100 μL आहे, घनता 1g/ml आहे असे गृहीत धरून.
2. समान व्हॉल्यूम बफर GDP जोडा, 7-10 मिनिटांसाठी 50~55℃ वर उष्मायन करा (जेलच्या आकारानुसार, जेल पूर्णपणे विरघळेपर्यंत उष्मायन वेळ समायोजित करा).उष्मायन दरम्यान ट्यूब 2 वेळा उलटा.
Δ बफर GDP च्या 1-3 खंड जोडल्याने DNA पुनर्प्राप्ती कार्यक्षमतेवर परिणाम होणार नाही.डीएनए तुकडा <100 bp पुनर्प्राप्त करायचा असल्यास, बफर GDP चे 3 खंड जोडणे आवश्यक आहे;जेलचा तुकडा पूर्णपणे विरघळल्यावर, 1 मात्रा आयसोप्रोपॅनॉल घाला आणि पूर्णपणे मिसळा, नंतर पुढील चरणावर जा.
3. नमुना ट्यूबच्या तळाशी आणण्यासाठी थोडक्यात सेंट्रीफ्यूज करा, फास्टप्युअर डीएनए मिनी कॉलम-जी कलेक्शन ट्यूब्स 2 मिली मध्ये घाला, द्रावण काळजीपूर्वक हस्तांतरित करा जास्तीत जास्त 700 μL एकदा.
गाळण्याची प्रक्रिया करण्यासाठी वेळ, 30-60 सेकंदांसाठी 12,000 rpm (13,800 X g) वर सेंट्रीफ्यूज.
4. फिल्टर टाकून द्या आणि कॉलममध्ये 300 μL बफर GDP जोडा, खोलीच्या तपमानावर 1 मिनिट उष्मायन करा, 30-60 सेकंदांसाठी 12,000 rpm (13,800 X g) वर सेंट्रीफ्यूज करा.
5. फिल्टर टाकून द्या आणि कॉलममध्ये 700 μL बफर GW (संपूर्ण इथेनॉल आधीच जोडले गेले आहे का ते तपासा!) जोडा, 30-60 सेकंदांसाठी 12,000 rpm (13,800 X g) वर सेंट्रीफ्यूज करा.
Δ कृपया शोषण स्तंभाच्या भिंतीभोवती बफर GW जोडा किंवा Buffer GW बॅक कव्हर जोडा आणि ट्यूबच्या भिंतीला चिकटलेले मीठ पूर्णपणे फ्लश करण्यासाठी 2-3 वेळा उलटा मिक्स करा.
6. चरण 5 पुन्हा करा.
Δ बफर GW सह दोनदा फ्लश केल्याने मीठ पूर्णपणे काढून टाकले जाईल आणि त्यानंतरच्या प्रयोगांवर होणारा परिणाम दूर होईल याची खात्री होऊ शकते.
7. फिल्टर टाकून द्या आणि 2 मिनिटांसाठी 12,000 rpm (13,800 X g) वर रिकाम्या स्तंभाला सेंट्रीफ्यूज करा.
8. स्वच्छ 1.5 मिली मायक्रोसेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये स्तंभ घाला, स्तंभाच्या पडद्याच्या मध्यभागी 20 - 30 μL इल्यूशन बफर घाला, 2 मिनिटे उबवा आणि नंतर 12,000 rpm (13,800 X ग्रॅम) वर अपकेंद्रित करा.स्तंभ टाकून द्या, प्राप्त केलेला डीएनए -20 वर संग्रहित करा.
Δ स्टेप 8 च्या सुपरनॅटंटला पुन्हा एल्युट करण्यासाठी कॉलममध्ये स्थानांतरित करणे आणि इल्यूशन बफर 55 वर प्रीहीट करणे (जेव्हा DNA फ्रॅगमेंट >3 kb) पुनर्प्राप्ती कार्यक्षमता वाढवण्यासाठी उपयुक्त ठरेल.
पीसीआर उत्पादने पुनर्प्राप्ती कार्यक्रम
हा प्रोटोकॉल पीसीआर उत्पादने, एंजाइमॅटिक रिॲक्शन सिस्टम आणि इतर डीएनए क्रूड उत्पादनांमधून (जेनेटिक डीएनएसह) डीएनए तुकड्यांना शुद्ध करण्यासाठी लागू आहे.हे द्रावण कार्यक्षमतेने विविध न्यूक्लियोटाइड्स, प्राइमर्स, प्राइमर डायमर, मीठ रेणू, एन्झाईम्स आणि इतर अशुद्धता काढून टाकू शकते.
1. थोडक्यात सेंट्रीफ्यूज पीसीआर उत्पादने, एंजाइमॅटिक रिॲक्शन सोल्यूशन आणि इतर डीएनए क्रूड उत्पादने.विंदुकाने त्यांच्या आवाजाचा अंदाज लावा आणि निर्जंतुकीकृत 1.5 मिली किंवा 2 मिली ट्यूबमध्ये स्थानांतरित करा.100 μL पर्यंत व्हॉल्यूम होईपर्यंत ddH2O जोडा;उच्च एकाग्रतेसह जीनोमिक DNA साठी, ddH2O सह 300 μL पर्यंत पातळ केल्याने पुनर्प्राप्ती कार्यक्षमता सुधारण्यास मदत होईल.
2. बफर जीडीपीचे 5 खंड जोडा, उलटे किंवा व्हर्टेक्सिंग करून पूर्णपणे मिसळा.100 bp > व्याजाचा DNA तुकडा असल्यास, इथेनॉलचे अतिरिक्त 1.5 खंड (नमुने + बफर GDP) जोडणे आवश्यक आहे.
3. कॉलम परत कलेक्शन ट्यूबमध्ये घाला, मिश्रण कॉलममध्ये स्थानांतरित करा, 30 - 60 सेकंदांसाठी 12,000 rpm (13,800 ×g) वर सेंट्रीफ्यूज करा.मिश्रित द्रावणाची मात्रा >700 μL असल्यास, शोषण स्तंभ परत संग्रह ट्यूबमध्ये ठेवा, उर्वरित द्रावण शोषण स्तंभात स्थानांतरित करा आणि 30 - 60 सेकंदांसाठी 12,000 rpm (13,800 × g) वर सेंट्रीफ्यूज करा.
4. पुढील कार्यप्रदर्शन 08- 1/जेल एक्स्ट्रॅक्शन प्रोग्रामच्या चरण 5 – 8 चा संदर्भ देते.
अर्ज
TAE किंवा TBE agarose जेलची विविध सांद्रता;पीसीआर उत्पादने, एंजाइमॅटिक रिॲक्शन सिस्टम किंवा इतर क्रूड डीएनए उत्पादने विविध पद्धतींनी मिळविली जातात.पासून वसूल केलेले तुकडे70 bp -20 kb.
नोट्स
फक्त संशोधनासाठी वापरा.निदान प्रक्रियेत वापरण्यासाठी नाही.
1. वापरण्यापूर्वी टॅगवर दर्शविल्यानुसार बफर GW पातळ करण्यासाठी 80 मिली इथेनॉल घाला, खोलीच्या तापमानावर ठेवा.
2. कमी-तापमान साठवण दरम्यान जर बफर जीडीपीचा अवक्षेप करणे सोपे असेल, तर ते वापरण्यापूर्वी काही कालावधीसाठी खोलीच्या तपमानावर ठेवले जाऊ शकते.आवश्यक असल्यास, ते 37℃ पाण्याच्या आंघोळीमध्ये प्रीफिटेट पूर्णपणे विसर्जित होईपर्यंत गरम केले जाऊ शकते आणि नंतर ते मिसळल्यानंतर वापरले जाऊ शकते.
3. पाण्याच्या आंघोळीचे तापमान आगाऊ 50 ~ 55℃ वर सेट करा.
4. 08-1/जेल एक्स्ट्रॅक्शन प्रोग्राम पायरी 1 मध्ये, जेल स्लाइसचा आकार कमी केल्याने विरघळण्याची वेळ लक्षणीयरीत्या कमी होईल आणि पुनर्प्राप्ती कार्यक्षमता वाढते (उच्च तापमानात सतत संपर्कात असताना लिनियराइज्ड डीएनए सहजपणे हायड्रोलायझ होऊ शकतो).DNA जेल ला UV ला जास्त काळ उघड करू नका, कारण अतिनील प्रकाशामुळे DNA चे नुकसान होऊ शकते.
5. 08- 1/जेल एक्स्ट्रॅक्शन प्रोग्राम पायरी 2 मध्ये जेल पूर्णपणे विसर्जित करा, अन्यथा DNA पुनर्प्राप्ती कार्यक्षमतेवर गंभीर परिणाम होईल.
6. प्रीहीट इल्युशन बफर किंवा ddH2O ते 55℃, जे DNA इल्युशन कार्यक्षमता सुधारण्यासाठी उपयुक्त आहे.DNA 2.5 mM Tris-HCl, pH 7.0 - 8.5 च्या एल्युएंटमध्ये साठवण्याची शिफारस केली जाते.
