प्लांट डायरेक्ट पीसीआर किट

मांजर क्रमांक: HCR2020A

प्लांट डायरेक्ट पीसीआर किट हे झाडाची पाने, बिया इत्यादींच्या थेट प्रवर्धनासाठी योग्य आहे आणि पॉलिसेकेराइड्स आणि पॉलिफेनॉल नसलेल्या वनस्पतींच्या नमुन्यांच्या उच्च-थ्रूपुट तपासणीसाठी वापरला जाऊ शकतो.निर्देशित उत्क्रांतीवर आधारित डायरेक्ट एम्प्लीफिकेशन डीएनए पॉलिमरेझमध्ये वनस्पतींमध्ये पीसीआर इनहिबिटर्सची उच्च सहिष्णुता आहे.दरम्यान, ते उच्च प्रवर्धन कार्यप्रदर्शन राखते, जे 5 kb च्या आत DNA तुकड्यांच्या प्रवर्धनासाठी योग्य आहे.किटमधील अद्वितीय Lysis बफर A चा वापर ताज्या किंवा गोठलेल्या वनस्पतीच्या ऊतींना लायझ करण्यासाठी केला जाऊ शकतो.हे ऑपरेट करणे सोपे आहे आणि शुद्धीकरणाशिवाय प्रवर्धनासाठी लायसेटचा वापर टेम्पलेट म्हणून केला जाऊ शकतो.सिस्टममध्ये संरक्षणात्मक घटक असतात जे क्रूड नमुने वारंवार गोठवल्यानंतर आणि वितळल्यानंतर प्रभावीपणे वाढवण्यास सक्षम करतात.2 × प्लांट डायरेक्ट मास्टर मिक्सला ॲम्प्लीफिकेशन रिॲक्शन करण्यासाठी फक्त प्राइमर्स आणि टेम्प्लेट्स जोडणे आवश्यक आहे, ज्यामुळे पाइपिंग ऑपरेशन्स कमी होतात आणि डिटेक्शन थ्रूपुट आणि परिणामांची पुनरुत्पादकता सुधारते.

घटक

*प्लांट डायरेक्ट लायसिस बफर बी हा एक पर्यायी अभिकर्मक आहे, ज्याचा वापर नमुन्यांचा स्टोरेज वेळ वाढवण्यासाठी प्लांट डायरेक्ट लायसिस बफर ए ला तटस्थ करण्यासाठी केला जातो.प्रत्यक्ष परिस्थितीनुसार त्याचा वापर करता येतो.

स्टोरेज अटी

2 × प्लांट डायरेक्ट मास्टर मिक्स, -30 ~ -15℃ वर साठवा आणि वारंवार गोठणे आणि वितळणे टाळा;प्लांट डायरेक्ट लिसिस बफर, -30 ~ -15℃ किंवा 2 ~ 8℃ वर स्टोअर करा.

प्रयोग प्रक्रिया

नमुना प्रक्रिया-वनस्पतीची पाने

थेट पद्धत:तरुण पाने वापरण्याची शिफारस केली जाते.एक लहान आणि एकसमान नमुना मिळविण्यासाठी 0.5 - 3 मिमीच्या निश्चित व्यासासह छिद्र पंच वापरा आणि नंतर नमुना थेट PCR प्रणालीमध्ये जोडा (50 μl प्रणालीची शिफारस केली जाते).लक्षात ठेवा, नमुना पीसीआर सोल्युशनमध्ये असल्याची खात्री करा आणि ट्यूबच्या भिंतीच्या विरुद्ध नाही.जर डायरेक्ट पीसीआरचा वापर लांब तुकडे आणि जटिल नमुने वाढवण्यासाठी केला जात असेल, तर टेम्प्लेट म्हणून लहान व्यासाचा (0.5 - 1 मिमी) नमुना वापरल्यास चांगले परिणाम मिळण्यास मदत होऊ शकते.

ग्राइंडिंग लिसिस पद्धत:तरुण पाने वापरण्याची शिफारस केली जाते.पानाचा एक छोटा तुकडा घ्या (सुमारे 1 - 3 मिमी व्यासाचा), तो 20 μl प्लांट डायरेक्ट लिसिस बफर ऍबमध्ये ठेवा आणि शक्य तितका बारीक करा (ही पायरी 100 μl पिपेट टीपने पान पिळून केली जाऊ शकते. नमुना मॅश करण्यासाठी).जर पानांच्या ऊतींचे मोठे खंड वापरले गेले (7 मिमी पेक्षा जास्त नसावे), तर डायल्यूशन बफरचे प्रमाण 50 μl पर्यंत वाढवा.पाने ग्राउंड झाल्यानंतर, द्रावण हिरवे दिसले पाहिजे.थोड्या सेंट्रीफ्यूगेशननंतर, पीसीआर प्रणालीमध्ये 1 μl सुपरनॅटंट प्रतिक्रिया टेम्पलेट म्हणून जोडा.

थर्मल लिसिस पद्धत:तरुण पाने वापरण्याची शिफारस केली जाते.पानाचा एक छोटा तुकडा घ्या (सुमारे 1 - 3 मिमी व्यासाचा), तो 20 μl प्लांट डायरेक्ट लिसिस बफर ए मध्ये ठेवा आणि 5 - 10 मिनिटांसाठी 95 डिग्री सेल्सियस वर गरम करा.ज्या पानांना लिसणे कठीण आहे (20 मिनिटांपेक्षा जास्त नाही) त्यांच्यासाठी लिसिसची वेळ योग्यरित्या वाढवता येते.जर पानांच्या ऊतींचे मोठे खंड वापरले गेले (7 मिमी पेक्षा जास्त नसावे), तर डायल्यूशन बफरचे प्रमाण 50 μl पर्यंत वाढवा.गरम केल्यानंतर, थोडक्यात सेंट्रीफ्यूज करा आणि प्रतिक्रिया टेम्पलेट म्हणून पीसीआर प्रणालीमध्ये 1 μl सुपरनॅटंट जोडा.

नमुना प्रक्रिया- बियाणे लावा

ग्राइंडिंग लिसिस पद्धत:5 मिमी व्यासाचे बियाणे कापण्यासाठी स्केलपेल वापरा, त्यांना 100 μl प्लांट डायरेक्ट लिसिस बफर ए मध्ये जोडा आणि नमुना पिपेट टिप किंवा इतर साधनांनी बारीक करा.थोडक्यात व्होर्टेक्स करा आणि खोलीच्या तपमानावर ३-५ मिनिटे उभे राहू द्या.बियाणे नमुना डायल्युशन बफरमध्ये बुडल्याची खात्री करा.एका संक्षिप्त सेंट्रीफ्यूगेशननंतर, प्रतिक्रिया टेम्पलेट म्हणून पीसीआर प्रणालीमध्ये 1 μl सुपरनॅटंट जोडा.

थर्मल लिसिस पद्धत:5 मिमी व्यासाचे बियाणे कापण्यासाठी स्केलपेल वापरा, त्यांना 100 μl प्लांट डायरेक्ट लायसिस बफर ए मध्ये जोडा आणि 5 - 10 मिनिटांसाठी 95°C वर गरम करा.ज्या पानांना फोडणे कठीण आहे (३० मिनिटांपेक्षा जास्त नाही) अशा पानांसाठी लिसिसची वेळ योग्यरित्या वाढवता येते.गरम केल्यानंतर, थोडक्यात सेंट्रीफ्यूज करा आणि पीसीआर सिस्टममध्ये प्रतिक्रिया टेम्पलेट म्हणून 1 μl सुपरनॅटंट जोडा.

aयोग्य आकाराचे नमुने कापण्यासाठी कात्री किंवा इतर साधने देखील वापरली जाऊ शकतात;जर पंच किंवा कात्री पुन्हा वापरल्या गेल्या असतील, तर प्रत्येक वापरापूर्वी 2% सोडियम हायपोक्लोराईटच्या द्रावणाने नमुन्यांमधील क्रॉस-दूषित होण्यापासून ते स्वच्छ केले पाहिजेत.

bप्लांट डायरेक्ट लिसिस बफर वापरण्यापूर्वी पूर्णपणे वितळले आहे याची खात्री करा.जर बफर चिकट असेल किंवा प्रक्षेपित असेल तर, वापरण्यापूर्वी ते पूर्णपणे वितळण्यासाठी ते 37℃ वर गरम केले जाऊ शकते.

cप्रतिक्रियेच्या प्रणालीमधील टेम्प्लेटची मात्रा वनस्पती सामग्री आणि जोडलेल्या पातळ पदार्थांमधील फरकानुसार योग्यरित्या समायोजित केली जाऊ शकते.

प्लांट डायरेक्ट लिसिस बफर

या उत्पादनामध्ये समाविष्ट असलेले प्लांट डायरेक्ट लायसिस बफर A हे बहुतेक वनस्पतींच्या ऊतींचे जीनोम सोडण्यासाठी काटेकोरपणे ऑप्टिमाइझ केले गेले आहे आणि 4℃ तापमानावर क्रूड वनस्पतींच्या अल्पकालीन साठवणीसाठी योग्य आहे.जर नमुना दीर्घ कालावधीसाठी (उदा. 1 – 2 महिने) साठवायचा असेल तर, सुपरनॅटंटला नवीन EP ट्यूबमध्ये हस्तांतरित करण्याची आणि -20℃ वर साठवण्याची शिफारस केली जाते.नमुने अधिक स्थिरपणे साठवण्यासाठी, ट्रान्सफर केलेल्या सुपरनॅटंटमध्ये प्लांट डायरेक्ट लायसिस बफर बी समान प्रमाणात जोडा, चांगले मिसळा आणि -20 डिग्री सेल्सियस वर साठवा.स्थिर स्टोरेज वेळ वनस्पतींचे नमुने आणि स्थितीनुसार बदलते.

प्रतिक्रिया प्रणाली

aत्यात एम.जी²⁺2 मिमीच्या अंतिम एकाग्रतेवर.

bप्रत्येक प्राइमरसाठी 0.4μM ची अंतिम एकाग्रता वापरण्याची शिफारस केली जाते.प्राइमर्सच्या अतिवापरामुळे अविशिष्ट प्रवर्धन वाढेल.

cवापरलेल्या नमुन्याचे प्रमाण वास्तविक परिस्थितीनुसार समायोजित केले जाऊ शकते.क्रूड लिस्ड नमुन्याच्या एका प्रतिक्रियेमध्ये वापरलेली रक्कम प्रतिक्रियेच्या एकूण व्हॉल्यूमच्या 2% - 20% दरम्यान समायोजित केली जाऊ शकते.जास्त नमुने वापरल्याने प्रवर्धन अयशस्वी होऊ शकते.

प्रतिक्रिया कार्यक्रम

aप्रारंभिक विकृतीकरण (98℃, 5 मिनिट) वनस्पतींच्या ऊतींच्या लिसिसला प्रोत्साहन देते, जीनोमिक डीएनए सोडते ज्याचा वापर पीसीआर प्रवर्धनासाठी केला जाऊ शकतो.वेळ कमी करू नका किंवा तापमान कमी करू नका.

bप्राइमर Tm मूल्याच्या बरोबरीने किंवा Tm मूल्यापेक्षा 2 ~ 4℃ जास्त सेट करण्याची शिफारस केली जाते.या उत्पादनामध्ये वापरलेले डायरेक्ट ॲम्प्लीफिकेशन डीएनए पॉलिमरेझ हे पारंपारिक Taq DNA पॉलिमरेझपेक्षा वेगळे आहे, आणि प्रतिक्रिया ॲनिलिंग तापमानासाठी विशेष आवश्यकता आहे; उच्च ॲनिलिंग तापमानाचा वापर प्रभावीपणे गैर-विशिष्ट प्रवर्धन कमी करू शकतो आणि ॲम्प्लीफिकेशन कार्यक्षमता सुधारू शकतो.क्लिष्ट टेम्प्लेटसाठी, ॲनिलिंग तापमान समायोजित करून आणि विस्तार वेळ वाढवून कार्यक्षम प्रवर्धन प्राप्त केले जाऊ शकते.

cप्रवर्धन उत्पादनाची लांबी ≤1 kb असल्यास, विस्तार वेळ 30 sec/kb वर सेट केला जातो;प्रवर्धन उत्पादनाची लांबी >1 kb असल्यास, विस्तार वेळ 60 se/kb वर सेट केला जातो.

dजटिल नमुने किंवा कमी प्रवर्धन उत्पन्न असलेल्या नमुन्यांसाठी, सायकलची संख्या योग्यरित्या 40 -50 सायकलपर्यंत वाढवता येते.

अर्ज

हे वनस्पतीच्या ऊतींचे थेट प्रवर्धन आणि पॉलिसेकेराइड्स आणि पॉलिफेनॉल नसलेल्या वनस्पतींच्या नमुन्यांच्या उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंगसाठी लागू आहे.

नोट्स

फक्त संशोधनासाठी वापरा.निदान प्रक्रियेत वापरण्यासाठी नाही.

1. क्रूड प्लांट ॲम्प्लिफिकेशन किंवा डायरेक्ट ॲम्प्लिफिकेशनसाठी, सिस्टीम, प्राइमर्स आणि ऑपरेशन्स बरोबर आहेत याची खात्री करण्यासाठी प्रयोग सुरू करण्यापूर्वी सकारात्मक नियंत्रण म्हणून शुद्ध जीनोमिक डीएनए वापरण्याची शिफारस केली जाते.

2. या किटमध्ये वापरल्या जाणाऱ्या डायरेक्ट एम्प्लिफिकेशन डीएनए पॉलिमरेजमध्ये मजबूत प्रूफरीडिंग क्रियाकलाप आहे.टीए क्लोनिंग करणे आवश्यक असल्यास, एडिनाइन जोडण्यापूर्वी डीएनए शुद्ध करण्याची शिफारस केली जाते.

3. प्राइमर डिझाइन मार्गदर्शन:

aप्राइमरच्या 3′ शेवटी शेवटचा बेस G किंवा C असावा अशी शिफारस केली जाते.

bप्राइमरच्या 3′ शेवटी शेवटच्या 8 बेसमध्ये लागोपाठ न जुळणे टाळले पाहिजे.cप्राइमरच्या 3′ शेवटी हेअरपिन स्ट्रक्चर्स टाळा.

dफॉरवर्ड प्राइमर आणि रिव्हर्स प्राइमरच्या Tm व्हॅल्यूमधील फरक 1℃ पेक्षा जास्त नसावा आणि Tm व्हॅल्यू 60 ~ 72℃ (Tm व्हॅल्यू मोजण्यासाठी Primer Premier 5 ची शिफारस केली जाते) मध्ये समायोजित केले पाहिजे.

eटेम्प्लेटशी न जुळणारे अतिरिक्त प्राइमर अनुक्रम, प्राइमर Tm मूल्याची गणना करताना समाविष्ट करू नये.

fप्राइमरची जीसी सामग्री 40% -60% असावी अशी शिफारस केली जाते.

gप्राइमरमध्ये A, G, C आणि T चे एकूण वितरण शक्य तितके समान असावे.उच्च GC किंवा AT सामग्री असलेले प्रदेश वापरणे टाळा.

hप्राइमरमध्ये किंवा दोन प्राइमर्समध्ये 5 किंवा अधिक बेसच्या पूरक अनुक्रमांची उपस्थिती टाळा आणि दोन प्राइमर्सच्या 3′ शेवटी 3 किंवा अधिक बेसच्या पूरक अनुक्रमांची उपस्थिती टाळा.

iअविशिष्ट प्रवर्धन टाळण्यासाठी प्राइमरची विशिष्टता तपासण्यासाठी NCBI BLAST फंक्शन वापरा.