प्रोटीनेज के एमएनजीएस (द्रव)
प्रोटीनेज के हे ब्रॉड सब्सट्रेट विशिष्टतेसह स्थिर सेरीन प्रोटीज आहे.हे डिटर्जंटच्या उपस्थितीतही मूळ स्थितीत अनेक प्रथिने खराब करते.क्रिस्टल आणि आण्विक संरचना अभ्यासातील पुराव्यांवरून असे सूचित होते की एंझाइम सक्रिय साइट उत्प्रेरक ट्रायडसह सबटिलिसिन कुटुंबातील आहे (Asp39-त्याचा69-सेर224).क्लीव्हेजचे मुख्य ठिकाण म्हणजे अवरोधित अल्फा अमिनो गटांसह ॲलिफॅटिक आणि सुगंधी अमीनो आम्लांच्या कार्बोक्सिल गटाला लागून असलेले पेप्टाइड बंध.हे सामान्यतः त्याच्या विस्तृत विशिष्टतेसाठी वापरले जाते.हे प्रोटीनेज के विशेषतः mNGS साठी डिझाइन केलेले आहे.इतर प्रोटीनेज K च्या तुलनेत, त्यात समान एंजाइमॅटिक कार्यक्षमतेसह अगदी कमी न्यूक्लिक ॲसिड दूषित आहे, जे डाउनस्ट्रीम एमएनजीएस ऍप्लिकेशनची अधिक चांगली खात्री करू शकते.
स्टोरेज अटी
2 वर्षांसाठी 2-8℃
तपशील
| देखावा | रंगहीन ते हलका तपकिरी द्रव |
| क्रियाकलाप | ≥800 U/ml |
| प्रथिने एकाग्रता | ≥20 mg/ml |
| निकसे | काहीही आढळले नाही |
| DNase | काहीही आढळले नाही |
| RNase | काहीही आढळले नाही |
गुणधर्म
| EC क्रमांक | ३.४.२१.६४(ट्रिटिराचियम अल्बममधील रीकॉम्बीनंट) |
| आयसोइलेक्ट्रिक पॉइंट | ७.८१ |
| इष्टतम पीएच | 7.0- 12.0 अंजीर 1 |
| इष्टतम तापमान | 65 ℃ अंजीर 2 |
| पीएच स्थिरता | pH 4.5- 12.5 (25 ℃, 16 h) अंजीर 3 |
| थर्मल स्थिरता | 50 ℃ खाली (pH 8.0, 30 मि) अंजीर 4 |
| स्टोरेज स्थिरता | 25 ℃ वर 12 महिन्यांसाठी 90% पेक्षा जास्त क्रियाकलाप |
| सक्रिय करणारे | एसडीएस, युरिया |
| अवरोधक | डायसोप्रोपिल फ्लोरोफॉस्फेट;फेनिलमेथाइलसल्फोनिल फ्लोराइड |
अर्ज
1. जेनेटिक डायग्नोस्टिक किट
2. आरएनए आणि डीएनए निष्कर्षण किट
3. ऊतकांमधून नॉन-प्रोटीन घटक काढणे, प्रथिने अशुद्धी कमी होणे, जसे की डीएनएलस आणि हेपरिनची तयारी
4. स्पंदित इलेक्ट्रोफोरेसीसद्वारे गुणसूत्र डीएनए तयार करणे
5. वेस्टर्न ब्लॉट
6. एंझाइमॅटिक ग्लायकोसिलेटेड अल्ब्युमिन अभिकर्मक इन विट्रो डायग्नोसिस
सावधगिरी
वापरताना किंवा वजन करताना संरक्षक हातमोजे आणि गॉगल घाला आणि वापरल्यानंतर हवेशीर ठेवा.या उत्पादनामुळे त्वचेची एलर्जी होऊ शकते आणि डोळ्यांची गंभीर जळजळ होऊ शकते.श्वास घेतल्यास, यामुळे ऍलर्जी किंवा दम्याची लक्षणे किंवा डिस्पनिया होऊ शकतो.श्वसनाचा त्रास होऊ शकतो.
युनिट व्याख्या
एक युनिट (U) ची व्याख्या 1 μmol तयार करण्यासाठी केसिनचे हायड्रोलायझ करण्यासाठी आवश्यक एंजाइमची मात्रा म्हणून केली जाते.खालील परिस्थितीत टायरोसिन प्रति मिनिट.
अभिकर्मक तयारी
अभिकर्मक I: 1g दुधाचे केसीन 0.1M सोडियम फॉस्फेट द्रावण (pH 8.0) च्या 50ml मध्ये विरघळले गेले, 65-70 ℃ पाण्यात 15 मिनिटे उबवले गेले, ढवळले आणि विरघळले, पाण्याने थंड केले, सोडियम हायड्रॉक्साईडने pH 8.0 पर्यंत समायोजित केले, आणि निश्चित केले 100 मि.ली.
अभिकर्मक II: 0.1M ट्रायक्लोरोएसिटिक ऍसिड, 0.2M सोडियम ऍसिटेट, 0.3M ऍसिटिक ऍसिड.
अभिकर्मक III: 0.4M Na2CO3उपाय.
अभिकर्मक IV: फोरिंट अभिकर्मक 5 वेळा शुद्ध पाण्याने पातळ केले जाते.
अभिकर्मक V: एन्झाइम डायल्युएंट: 0.1M सोडियम फॉस्फेट द्रावण (पीएच 8.0).
अभिकर्मक VI: टायरोसिन द्रावण: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml टायरोसिन 0.2 सह विसर्जितएम एचसीएल.
कार्यपद्धती
1. 0.5 मिली अभिकर्मक I 37 डिग्री सेल्सियस पर्यंत पूर्व-उबदार केले जाते, 0.5 मिली एंजाइम द्रावण घाला, चांगले मिसळा आणि उष्मायन करा10 मिनिटांसाठी 37℃.
2. प्रतिक्रिया थांबवण्यासाठी 1 मिली अभिकर्मक II घाला, चांगले मिसळा आणि 30 मिनिटे उष्मायन सुरू ठेवा.
3. सेंट्रीफ्यूगेट प्रतिक्रिया समाधान.
4. 0.5ml supernatant घ्या, 2.5ml अभिकर्मक III, 0.5ml अभिकर्मक IV जोडा, चांगले मिसळा आणि 37℃ वर उबवा.30 मिनिटांसाठी.
5. OD६६०OD म्हणून निर्धारित केले होते1;रिक्त नियंत्रण गट: 0.5ml अभिकर्मक V चा वापर एन्झाइम बदलण्यासाठी केला जातोOD निश्चित करण्यासाठी उपाय६६०OD म्हणून2, ΔOD=OD1-OD2.
6. L-टायरोसिन मानक वक्र: 0.5mL भिन्न एकाग्रता L-टायरोसिन द्रावण, 2.5mL अभिकर्मक III, 0.5mL अभिकर्मक IV 5mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये, 30mins साठी 37℃ मध्ये उबवणे, OD साठी शोधणे६६०एल-टायरोसिनच्या वेगवेगळ्या एकाग्रतेसाठी, नंतर मानक वक्र Y=kX+b प्राप्त केले, जेथे Y हा L-टायरोसिन एकाग्रता आहे, X हा OD आहे600.
गणना
2: प्रतिक्रिया समाधानाची एकूण मात्रा (mL)
0.5: एंजाइम द्रावणाचे प्रमाण (mL)
0.5: क्रोमोजेनिक निर्धारण (mL) मध्ये वापरलेली प्रतिक्रिया द्रव मात्रा
10: प्रतिक्रिया वेळ (मि.)
Df: सौम्यता अनेक
C: एन्झाइम एकाग्रता (mg/mL)
संदर्भ
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);२३:७७.
2. Wieger U & Hilz H. बायोकेम.बायोफिज.रा.कम्युन.(1971);४४:५१३.
3. हिल्झ, एच.इत्यादी.,युरो.जे. बायोकेम.(1975);५६:१०३–१०८.
4. सॅमब्रुक जेet अल., आण्विक क्लोनिंग: एक प्रयोगशाळा मॅन्युअल, दुसरी आवृत्ती, कोल्ड स्प्रिंग हार्बरप्रयोगशाळा प्रेस, कोल्ड स्प्रिंग हार्बर (1989).
आकडे
अंजीर.1 इष्टतम pH
100mM बफर सोल्यूशन:pH6.0-8.0, Na-phosphate;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glycine-NaOH. एन्झाइम एकाग्रता: 1mg/mL
Fig.2 इष्टतम तापमान
20 मिमी के-फॉस्फेट बफर pH 8.0 मध्ये प्रतिक्रिया.एंझाइम एकाग्रता: 1 mg/mL
Fig.3 pH स्थिरता
25 ℃, 50 मिमी बफर सोल्यूशनसह 16 एच-उपचार: पीएच 4.5- 5.5, एसीटेट;पीएच 6.0-8.0, ना-फॉस्फेट;pH 8.0-9.0, Tris-एचसीएलpH 9.0- 12.5, Glycine-NaOH.एंझाइम एकाग्रता: 1 mg/mL
Fig.4 थर्मल स्थिरता
50 मिमी ट्रिस-एचसीएल बफर, पीएच 8.0 सह 30 मिनिट-उपचार.एंझाइम एकाग्रता: 1 mg/mL
Fig.5 स्टोरेज स्थिरty at 25℃
