हॉटस्टार्ट Taq DNA पॉलिमरेझ
हॉट स्टार्ट टाक डीएनए पॉलिमरेझ (अँटीबॉडी मॉडिफिकेशन) थर्मस ॲक्वाटिकस YT-1 मधील हॉट-स्टार्ट थर्मोस्टेबल डीएनए पॉलिमरेझ आहे, ज्यामध्ये 5′→3′ पॉलिमरेझ क्रियाकलाप आणि 5' फ्लॅप एंडोन्यूक्लीज क्रियाकलाप आहे.हॉट-स्टार्ट Taq DNA पॉलिमरेझ हे Taq DNA पॉलिमरेझ आहे जे थर्मोलाबिल Taq ऍन्टीबॉडीजने सुधारित केले आहे.ऍन्टीबॉडी बदलामुळे पीसीआरची विशिष्टता, संवेदनशीलता आणि उत्पन्न वाढले.
घटक
| घटक | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq बफर | 4×1 मिली | 4×10 मिली | 4×50 मिली | ५×४०० मिली |
| हॉट स्टार्ट Taq DNA पॉलिमरेझ (अँटीबॉडी सुधारित) (5 U/μL) | 0.1 मिली | 1 मिली | 5 मिली | 10×5 मिली |
अर्ज
10 mM Tris-HCl (pH 7.4 at 25℃), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0.5% Tween20, 0.5% IGEPALCA-630 आणि 50% ग्लिसरॉल.
स्टोरेज स्थिती
वाहतूक 0°C च्या खाली आणि -25°C~-15°C वर साठवली जावी.
युनिट व्याख्या
75 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 30 मिनिटांत 15 एनएमओएल डीएनटीपी ऍसिडमध्ये अघुलनशील पदार्थामध्ये समाविष्ट करणाऱ्या एन्झाइमचे प्रमाण म्हणून एक युनिट परिभाषित केले जाते.
गुणवत्ता नियंत्रण
1.Endonuclease क्रियाकलाप:4 μg pUC19 DNA सह 20 U एंझाइमचे 37° तापमानात 4 तास उष्मायन केल्याने जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसने निर्धारित केल्याप्रमाणे डीएनएचे कोणतेही ऱ्हास होऊ शकला नाही.
2.5 kb लॅम्बडा पीसीआर:200 µM dNTPs आणि 0.2 µM प्राइमर्सच्या उपस्थितीत Taq DNA पॉलिमरेझच्या 1.25 युनिटसह 5 ng Lambda DNA चे PCR प्रवर्धनाचे 25 चक्र अपेक्षित 5 kb उत्पादनात परिणाम करतात.
3.Exonuclease क्रियाकलाप:किमान 12.5 U Taq DNA पॉलिमरेझ 10 nmol 5´-FAM ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड असलेली 50 μl प्रतिक्रिया 37℃ वर 30 मिनिटांसाठी उष्मायन केल्याने शोधण्यायोग्य ऱ्हास मिळत नाही.
4.RNase क्रियाकलाप:37°C तापमानात 2 तासांसाठी 1μg RNA प्रतिलेखांसह 20 U एंझाइम असलेल्या 10 µL प्रतिक्रियेच्या उष्मायनामुळे जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसने निर्धारित केल्याप्रमाणे आरएनएचे कोणतेही ऱ्हास होऊ शकले नाही.
5.उष्णता निष्क्रियता:नाही.
प्रतिक्रिया प्रणाली
| घटक | खंड |
| टेम्पलेट डीएनएa | पर्यायी |
| 10 μM फॉरवर्ड प्राइमर | 0.5 μL |
| 10 μM रिव्हर्स प्राइमर | 0.5 μL |
| dNTP मिक्स (प्रत्येकी 10 मिमी) | 0.5 μL |
| 5×HC Taq बफर | 5 μL |
| Taq DNA पॉलिमरेझb(5U/μL) | 0.125 μL |
| न्यूक्लीज मुक्त पाणी | 25 μL पर्यंत |
टिपा:
1) अ.
| डीएनए | रक्कम |
| जीनोमिक | 1 एनजी -1 μg |
| प्लाझमिड किंवा व्हायरल | 1 pg-1 एनजी |
2) बी.Taq DNA पॉलिमरेझची इष्टतम एकाग्रता 5-50 युनिट्स/mL (0.1-0.5 युनिट्स/25 μL प्रतिक्रिया) पर्यंत विशेष अनुप्रयोगांमध्ये असू शकते.
थर्मल सायकलिंग प्रोटोकॉल
पीसीआर
| पाऊल | तापमान(°C) | वेळ | सायकल |
| प्रारंभिक विकृतीकरणa | 95 ℃ | १-३ मि | - |
| विकृतीकरण | 95 ℃ | 15-30 से | 30-35 सायकल |
| एनीलिंगb | 45-68 ℃ | 15-60 से | |
| विस्तार | 68 ℃ | 1kb/मिनिट | |
| अंतिम विस्तार | 68 ℃ | ५ मिनिटे | - |
टिपा:
1) 95 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 1 मिनिटाचे प्रारंभिक विकृतीकरण बहुतेक प्रवर्धनांसाठी पुरेसे आहे.कठीण टेम्प्लेटसाठी, 95 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 2-3 मिनिटे लांब विकृतीकरण करण्याची शिफारस केली जाते.कॉलनी पीसीआर सह, 95 डिग्री सेल्सिअस तापमानात प्रारंभिक 5 मिनिटे विकृतीकरण करण्याची शिफारस केली जाते.
2) एनीलिंगची पायरी सामान्यत: 15-60 से.ॲनिलिंग तापमान हे प्राइमर जोडीच्या Tm वर आधारित असते आणि सामान्यत: 45-68℃ असते.
